志賀氏血清作為診斷志賀氏菌感染的關鍵試劑,其制備工藝、標化精度與質(zhì)量控制直接決定檢測結果的準確性。以下從三大核心環(huán)節(jié)展開技術解析。?
一、制備:嚴謹把控免疫與純化流程?
制備需以高純度志賀氏菌標準菌株為基礎。首先選取具有典型抗原性的菌株(如痢疾志賀氏菌1型、福氏志賀氏菌2a型),經(jīng)固體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)后,通過甲醛滅活處理確保安全性,同時保留完整O抗原結構。隨后采用家兔作為免疫動物,按照“基礎免疫-加強免疫”程序注射菌液,首劑加佐劑增強免疫應答,后續(xù)每隔7天追加免疫,直至血清凝集效價達標。?
免疫結束后,采集兔血并分離血清,需通過3步純化提升特異性:一是56℃30分鐘滅活補體,避免干擾后續(xù)反應;二是采用硫酸銨鹽析法沉淀免疫球蛋白,去除雜蛋白;三是通過透析脫鹽與凝膠過濾層析,最終獲得純度≥90%的免疫球蛋白G(IgG)組分,確保血清不含非特異性抗體。?
二、標化:建立精準的效價與特異性標準?
標化是保障血清實用性的核心環(huán)節(jié),需圍繞效價標定與特異性驗證雙維度開展。效價測定采用微量凝集法,將血清進行倍比稀釋后與標準菌液反應,以出現(xiàn)“++”凝集的最高稀釋度為終點效價,要求診斷用血清效價不低于1:1280,參考血清不低于1:2560。?
特異性驗證需通過交叉凝集試驗排除干擾:一方面與其他志賀氏菌血清型菌株反應,確認無交叉凝集;另一方面與大腸埃希菌、沙門氏菌等近緣菌反應,確保無假陽性。同時采用Westernblot檢測,驗證血清僅與志賀氏菌O抗原蛋白特異性結合,分子量偏差需控制在±5%以內(nèi)。?
三、質(zhì)控:構建全流程質(zhì)量保障體系?
質(zhì)控需覆蓋生產(chǎn)全周期,設立三大關鍵節(jié)點。原料質(zhì)控要求菌株純度≥99.9%,無噬菌體污染;過程質(zhì)控通過實時監(jiān)測免疫兔抗體水平,確保效價波動≤10%;成品質(zhì)控實施雙重檢測,既通過無菌試驗確認無微生物污染,又通過穩(wěn)定性試驗驗證2-8℃儲存6個月內(nèi)效價下降不超過15%。?
此外,需建立追溯體系,每批次血清附帶批號,記錄生產(chǎn)、標化、質(zhì)控數(shù)據(jù),同時定期與國家參考品比對,確保量值溯源準確性,最終實現(xiàn)志賀氏血清從制備到應用的全程質(zhì)量可控。